Устранение неполадок в иммунофлуоресценции: избыточный (яркий) сигнал | Технические советы CST

Ваше иммунофлуоресцентное изображение (ИФ) выглядит как яркий беспорядок? Давайте разберемся с возможными причинами. 👉Подпишитесь: http://youtube.com/user/cellsignaldotcom?sub_confirmation=1 👉Протоколы и устранение неполадок CST: http://cellsignal.com/protocols 👉Свяжитесь с ученым CST: http://cellsignal.com/support 💡 Получите информацию и советы по методам, публикациям и построению научной карьеры: https://www.cellmentor.com/ Транскрипт: Как устранить проблему избыточного сигнала в иммунофлуоресценции? Я Джинни Бейн, научный сотрудник группы валидации иммунофлуоресценции в Cell Signaling Technology, и это CST Tech Tips. Когда вы анализируете данные под микроскопом, то, что вы видите, имеет значение. Когда вы видите то, что ожидаете увидеть, это замечательно. Но вот что нужно делать, если вы видите что-то неожиданное. В этом видео мы поговорим о том, что означает «слишком сильный сигнал», о потенциальных причинах и способах решения этой проблемы. Во-первых, слишком сильный сигнал может быть вызван чрезмерной фиксацией. В этом случае весь ваш образец будет светиться. Чтобы решить эту проблему, попробуйте сократить период фиксации. Время фиксации зависит от размера образца ткани, но для небольших кусочков ткани и клеток обычно достаточно 15 минут. Убедитесь, что используете 4% формальдегид при комнатной температуре или 4 градусах Цельсия. Еще одна распространенная проблема, вызывающая слишком сильный сигнал, — это высыхание клеток или ткани после добавления буферов, содержащих белок. Это вызывает интенсивную автофлуоресценцию. Чтобы предотвратить это, убедитесь, что быстро меняете буферы и используете достаточное количество буфера, чтобы предотвратить высыхание во время инкубации. Вы также можете сделать увлажненную камеру, видео об этом появится позже. Если ваш контрольный слайд выглядит чистым, но вы видите слишком сильный сигнал в экспериментальных образцах, возможно, вы использовали слишком много антител. При использовании избытка антител может возникнуть слишком сильный сигнал, поэтому убедитесь, что вы правильно титруете антитела или используете рекомендуемое разведение, указанное на странице продукта. Вы можете наблюдать избыточный сигнал из-за вторичного антитела. Любые присутствующие вторичные конъюгаты будут флуоресцировать, даже если они не связаны с первичным антителом. Если все поле зрения микроскопа светится, возможно, вы не смыли вторичное антитело. Это можно исправить дополнительным промыванием PBS. Также возможно неспецифическое связывание вторичного антитела с образцом при длительной инкубации или при высокой температуре. Чтобы предотвратить это, убедитесь, что вторичное антитело не остается на образце более 2 часов при комнатной температуре. Наконец, если сигнал специфический, но очень сильный, он может насытить детектор, что приведет к потере динамического диапазона, а также может вызвать спектральное просачивание в другой канал. В этом случае вы можете попробовать использовать меньшее количество антител или просто отрегулировать время экспозиции или мощность лазера, чтобы использовать весь динамический диапазон. Надеюсь, это видео будет полезным! Пожалуйста, подпишитесь на наш канал, чтобы получать больше технических советов и видеороликов по устранению неполадок в иммунофлуоресценции. Вы всегда можете найти протоколы для каждого антитела на сайте http://cellsignal.com. А если у вас есть вопросы об антителе или протоколе, свяжитесь с ученым на сайте http://cellsignal.com/support. Удачи в ваших экспериментах! 👉О компании CST: Cell Signaling Technology (CST) — это частная семейная компания, основанная учеными и занимающаяся предоставлением высококачественных исследовательских инструментов для биомедицинского исследовательского сообщества. Наши сотрудники работают по всему миру из нашей штаб-квартиры в Массачусетсе, США, а также наших офисов в Нидерландах, Китае и Японии. http://cellsignal.com/about #CSTTechTips #Иммунофлуоресценция #антитело #протокол #устранениенеполадок