FRET, флуорофоры и флуоресценция — концепции и примеры.

Не используйте FRET — вот основные моменты, которые нужно знать о FRET! (Фёрстеровский или флуоресцентный резонансный перенос энергии) — краткий тезис, а затем подробности: У вас есть 2 флуорофора — один имеет длину волны излучения (и, следовательно, энергию), которая совпадает с длиной волны поглощения (и, следовательно, энергией) другого. Если они очень близки, и вы возбуждаете первый, энергия, которая должна была быть испущена в виде света первым, будет вместо этого украдена вторым, и тогда второй начнет излучать свет. * Эффективность FRET (E) зависит от расстояния и уменьшается в зависимости от расстояния в шестой степени. Вам нужно находиться в пределах ~10 нм. Фактическое расстояние зависит от значения R0, которое представляет собой 50% эффективность переноса (E) (обычно 3-7 нм). Существует математическое уравнение, связывающее расстояние с эффективностью FRET для данной пары. Вы можете использовать FRET в качестве «спектроскопической линейки» для измерения расстояний внутри и между молекулами. Блог: https://bit.ly/FRET_2 Более подробная версия: http://bit.ly/fretandfluorescence Держите своих друзей близко, а партнеров по FRET еще ближе! В основе флуоресценции лежит то, что молекулы, называемые флуорофорами, поглощают высокоэнергетический свет и используют часть этой энергии для возбуждения электрона (подобно перемещению его вверх по этажам в электронном многоквартирном доме, где разные этажи находятся в разных энергетических состояниях). Затем этот электрон падает обратно вниз, испуская свет с более низкой энергией, который мы можем обнаружить. В методе FRET (резонансный перенос энергии Фёрстера) мы связываем два флуорофора (представьте два расположенных рядом многоквартирных дома). Вместо того чтобы получать энергию от света, второй флуорофор получает энергию от первого – электрон «спускается вниз» в первом доме, а электрон «поднимается вверх» во втором. Это возможно только в том случае, если они находятся очень близко друг к другу, поэтому, если мы видим флуоресценцию от второго флуорофора, мы можем сказать, что молекулы взаимодействуют. Эта энергия, передаваемая от первого ко второму, не в форме света (она НЕИЗЛУЧАЮЩАЯ). Она передается посредством так называемого резонансного переноса энергии Фёрстера. При этом нет никаких частиц, перетекающих от одного флуорофора к другому (нет фотонов или электронов), только энергетические «вибрации». Если представить энергию как своего рода «деньги», а фотоны как «монеты», то флуоресценция будет похожа на то, как если бы вы взяли десятицентовую монету и вернули пятицентовую (часть энергии используется для «покачивания» и тому подобного). FRET, с другой стороны, больше похож на своего рода банковский перевод, и такой перевод возможен только в том случае, если молекулы находятся очень близко друг к другу. И под «близко» я подразумеваю ДЕЙСТВИТЕЛЬНО близко. Видимый свет имеет длину волны ~380-740 нм (в метре 1 миллиард нм). А FRET может происходить только на расстояниях менее 10 нм. Для сравнения, «средняя» человеческая клетка имеет размер ~20 000 нм (20 мкм), длина связей составляет ~0,15 нм, а «средний» белок имеет диаметр ~4-5 нм (посмотрите сайт bionumbers, чтобы узнать еще больше интересных фактов). Примечание: иногда значения указываются в ангстремах (Å) — один ангстрем равен 0,1 нМ. Способность к возникновению FRET быстро уменьшается с расстоянием — эффективность FRET (E) изменяется обратно пропорционально шестой степени расстояния между ними (r). EFRET = 1/[1 + (r/R0)6] R0 — радиус Фёрстера, и это расстояние, на котором E достигает 50% от своего максимума. Обычно это несколько нанометров. Когда r меньше R0, FRET очень эффективен, но как только вы превысите R0, эффективность быстро снижается благодаря этой «в шестой степени», с полезным диапазоном ~ 0,5-1,5 x R0. Это требование близости может быть действительно полезным. Возможно, вы видели микроскопические изображения, где клетки окрашивают красителем, который связывается с одним веществом, и другим красителем, который связывается с другим веществом, а затем накладывают изображения друг на друга? Может показаться, что молекулы находятся очень близко — они «совместно локализуются», — но они могут и не взаимодействовать напрямую. Но с помощью FRET вы точно знаете, что они взаимодействуют. Существует множество различных «версий» FRET. Краткое замечание о хромофорах и флуорофорах. Хромофоры — это молекулы, которые поглощают свет. Если они отражают свет, мы называем их флуорофорами. Они поглощают и излучают свет только определенных длин волн, в зависимости от их молекулярного состава, поэтому каждый из них имеет свой собственный спектр поглощения (возбуждения) и излучения. Подробнее здесь: http://bit.ly/fretandfluorescence «Классический» подход заключается в том, чтобы взять два флуорофора и позволить одному из них выступать в качестве донора, передавая энергию акцептору. Если вы направите свет на длину волны, которую может поглотить донор, донор сможет поглотить его, и если его спек...